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SA-β-gal的檢測方法,你了解多少?

更新時(shí)間:2021-09-16   點(diǎn)擊次數:8814次
  生衰退的變化過(guò)程。細胞衰老時(shí),衰老相關(guān)半乳糖苷酶(SA-β-gal)的活性會(huì )顯著(zhù)增加,故常常檢測衰老相關(guān)半乳糖苷酶的活性以區分正常細胞與衰老細胞。目前,不同條件或化合物作用細胞后,常常用衰老相關(guān)半乳糖苷酶檢測作為細胞衰老的標志之一。
 
  SA-β-gal檢測方法主要分為細胞化學(xué)染色法和熒光法。
 
  一、細胞化學(xué)染色法:SA-βgal在pH6.0時(shí),可將5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷水解,產(chǎn)生不溶于水的藍色物質(zhì)。這種藍色產(chǎn)物相當穩定,固定干燥后避光可保存幾個(gè)月。通過(guò)計算總群體中藍色細胞的數量,可以很容易地確定SA-β-半乳糖苷酶陽(yáng)性的細胞比例,即衰老細胞的比例。但是需要注意的是,在所有細胞中普遍存在酸性半乳糖苷酶,在pH4.0時(shí)發(fā)揮作用。其實(shí)SA-βgal發(fā)揮作用的最適pH為4.5,但是在pH4.5時(shí),酸性半乳糖苷酶也會(huì )水解底物,因此需要使用SA-βgal次適pH6.0,才能確保藍色產(chǎn)物是由于SA-βgal的作用而產(chǎn)生的。通常我們使用pH為6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。
 
  二、熒光法:熒光法需要借助另一種底物——C12FDG,不具有熒光,能透過(guò)細胞膜,但被βgal水解后可產(chǎn)生綠色熒光產(chǎn)物。利用流式細胞儀可檢測綠色熒光的產(chǎn)生,藉此反映βgal的表達。因此要想檢測SA-βgal的活性,需要先將溶酶體堿化至pH6.0。這一過(guò)程可使用氯喹或巴弗洛霉素A1等,可降低溶酶體的酸度,使溶酶體堿化至pH6.0。然后向細胞中加入C12FDG,孵育后制成可供流式分析細胞懸液,即可利用FC500MPL流式細胞儀等檢測SA-βgal的表達。
 
  SA-β-gal細胞化學(xué)染色法通常需要半小時(shí)染色,數小時(shí)甚至一天時(shí)間等待染色完成以觀(guān)察和計數,而熒光法需要4至8小時(shí)處理細胞,1天內可完成計數。前者不僅可用于細胞培養液還可用以組織切片的染色,而且所需試劑和設備簡(jiǎn)單,而后者更為高效,靈敏,定量更為準確。因此,根據實(shí)驗的不同目的可選擇不同的檢測方法。

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